19世紀の学者たちは、発酵は生きた細胞だけが行える“生命現象”だと考えていました。ブフナーは酵母を砂と一緒にすりつぶし、ろ紙でこして細胞成分を取り除いた『酵母抽出液』を作成しました。その液体に砂糖を加えると、炭酸ガスが発生しアルコールが生成されることを確認しました。これは、酵母細胞外でも化学反応が進むこと、すなわち酵素という触媒が存在することを示しています。この成果は活力論を打ち破り、生化学という新しい学問分野の扉を開きました。現在の医薬品製造やバイオ燃料生産にもつながる基礎知識となっています。

ブフナーは1897年、酵母を石英粉とともに乳鉢で粉砕し、硫酸マグネシウムなどを加えて圧搾することで細胞片をほぼ含まないPresssaft（圧搾汁）を作成しました。この抽出液は無菌であることを確認しつつ、ショ糖溶液を加えると温度とpHに依存してCO₂とエタノールを定量的に生成しました。彼は触媒因子を「ジマ-酵素（Zymase）」と命名し、タンパク質触媒の存在を予見しました。結果はパスツール以来支配的だった活力論を覆し、酵素精製やミカエリス–メンテン速度論、エムデン–マイヤーホフ経路の解明へと発展しました。また、醸造学や食品工業における工程最適化の理論的基盤を提供し、現代バイオテクノロジーの礎となっています。

ブフナーのプロトコルは物理破砕と浸透圧ショックを組み合わせた細胞溶解系で、現代のcell-free extract調製法の先駆けである。Presssaftの活性は60 ℃加熱で失活し、触媒が熱変性タンパク質であることが示唆された。彼は気体容量法でCO₂生成速度と基質濃度の比例関係を定量し、酸処理や高温処理による阻害試験で特異性を検証した。Zymaseは後にヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼなど複数酵素群で構成されることが判明する。in vitro再構成アッセイと代謝経路解析を可能にした点で、彼の研究は酵素学と代謝工学の端緒となった。また、触媒タンパク質を定量的に扱う概念はサムナーの酵素結晶化やミカエリス–メンテン速度論の成立を促進し、工業的エタノール発酵のスケールアップにも影響を与えた。