発酵とは、細胞が酸素を使わずに糖を分解し、アルコールや二酸化炭素を作る過程です。19世紀には、発酵は生きた細胞だけが行える“生命の神秘”と考えられていました。ハーデンは酵母細胞をつぶし、ろ過した“酵母汁”でも発酵が続くことを実験で示しました。さらに無機リン酸を加えると反応速度が上がることから、酵素反応にリン酸が重要であることを発見しました。オイラー＝ケルピンは、この反応を助ける補助分子“コエンザイム”を分離し、その正体が後にNAD⁺と呼ばれる物質であると突き止めました。これらの研究により、発酵は一連の化学反応の連鎖（代謝経路）であるという理解が確立しました。現在の解糖系の教科書的な図は、この時代の成果からスタートしています。食品産業では、温度や栄養塩を調整して発酵速度を最適化する技術が発達し、パン、ビール、みそなどの大量生産が可能になりました。医療現場でも、酵素やコエンザイムの欠損が起こす病気を診断するヒントになっています。つまり、彼らの業績は日常と産業の両方で大きな価値を生んでいるのです。

ハーデンとヤングは1906年、細胞外の酵母抽出液（zymase）に無機リン酸を添加すると糖分解速度が飛躍的に増大し、同時に可溶性リン酸エステルが生成することを報告した。生成物は後にフルクトース1,6-ビスリン酸と同定され、解糖系における最初のエネルギー投資段階の存在を示唆した。彼らは二酸化炭素発生量とグリセロール生成量の定量測定から、糖1モル当たりCO₂ 2モル、エタノール2モルという発酵の化学量論を確立している。オイラー＝ケルピンは“cozymase”と呼ばれた熱に弱い低分子画分を分離し、これが発酵を再活性化することを示した。1920年代に彼はこの補因子がジヌクレオチド構造を持つピリジンヌクレオチドであると推定し、後のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）の同定につながった。この知見は、酸化還元補酵素による電子授受が代謝経路を駆動するという概念を生み、バイオエネルゲティクス研究の礎となった。両者の業績は、ワールブルク、エムデン、マイヤーホフらの研究と結びつき、現在の解糖系（Embden–Meyerhof–Parnas pathway）の完成を支えた。発酵の段階的なエネルギー変換モデルは、ATPおよび中間体リン酸化体の発見にも寄与し、生体が化学エネルギーを獲得・保存する仕組みの理解を深めた。現代では、酵母の代謝工学やバイオ燃料生産、乳酸発酵乳の品質制御など、多岐にわたる応用が展開している。さらに、解糖系酵素の阻害剤はがん細胞の代謝リプログラミングを標的とする創薬分野でも注目されている。1929年のノーベル化学賞は、これらの基礎的かつ応用的価値を評価したものであった。

ハーデンは酵母無細胞抽出液のin vitro発酵を定量するために微量気体量測定装置を用い、pO₂を限定した嫌気条件下でのCO₂放出速度を時間分解で解析した。彼は無機リン酸依存性の初速増加を観察し、同時に生成する酸可溶性リン酸エステルを陰イオン交換クロマトで精製し、後にHaberlandと共同で当該化合物をヘキソース2,6-ビスリン酸として報告した。オイラー＝ケルピンは熱失活したzymaseを透析し、低分子画分をニトロソ化クロマトグラフィーで分離、補酵素活性を回復させる因子としてcozymaseを同定した。彼の後継研究により、cozymaseがピリジンヌクレオチド骨格を持ち、1929年のKarrerらによるNAD⁺結晶化に道を開いた。ハーデンの当量測定はCO₂生成とリン酸消費のモル比が2:1であることを示し、酵母発酵におけるリン酸循環モデルの基盤を提供した。彼らのデータはEmbden–Meyerhof–Parnas経路のAB段階（フルクトース6-リン酸のリン酸化、フルクトース1,6BPの分裂）を定式化する際の実験的裏付けとなった。さらに、オイラー＝ケルピンはジニトロフルオレン誘導体を用いたzymase阻害実験から、coenzymeの活性位置がプリン/ピリジン環上のN位にあることを示唆した。これら知見は、酸化還元ポテンシャル差による代謝エネルギー移換理論（Lohmann–Meyerhof仮説）の前提条件となった。今日に至るまで、細胞外酵素系を用いた再構築発酵は、合成生物学におけるATPフリー生産プラットフォームとして再評価されている。ハーデンとオイラー＝ケルピンの方法論は、メタボローム解析やフラックスバランス解析の前身とも言える化学量論的視点を提供し、代謝工学の数理モデル構築に直接的影響を与えた。彼らの研究は、酵素学と生化学の学問的分化を決定づけ、膜を持たない系でもエネルギー変換が起こり得ることを実証した点で、現在のバイオカタリシス理論においても引用され続けている。