生物の呼吸は肺でのガス交換だけでなく、細胞内で進む酸化還元反応の連続です。1920年代、ワールブルクは自作のマノメーター（ワールブルク装置）で組織片の酸素消費量を精密に測定しました。その結果、鉄を含む色素タンパク質シトクロムが酸化型と還元型を行き来して電子を運ぶことを突き止め、これを「呼吸酵素」と総称しました。さらに、シトクロムが酸素と反応して水を生む終端酸化酵素（シトクロムオキシダーゼ）が存在することを示しました。これらの成果は、後に電子伝達系として知られる分子の並びと機能を考える出発点となりました。ATPがどのように作られるかを議論するうえでも彼のデータは基準とされました。がん細胞の代謝異常（ワールブルク効果）など医学分野への応用も広がっています。

ワールブルクは好気的呼吸速度を定量化するため、閉鎖系マノメトリー法を改良して温度補正付きのワールブルク装置を開発しました。この装置で組織抽出物の酸素消費速度（QO2）をリアルタイムに記録し、同時に吸収スペクトルを測定して570 nm付近に可逆的な吸光度変化を示すヘムタンパク質を検出しました。後にデイヴィッド・ケイリンが「シトクロム」と命名したこれらのタンパク質は段階的な酸化還元電位を持ち、電子を次々に受け渡すことが示唆されました。ワールブルクはさらに、シトクロムa/a3が酸素を4電子で還元して水を生成する反応を担うと提案し、これを「呼吸酵素（Atmungsferment）」と呼びました。酸素消費量と生成水量の化学量論的一致を示したことで反応の整合性が裏付けられ、ミトコンドリア内膜に存在する電子伝達系という概念の先駆けとなりました。ワールブルク装置の普及は代謝阻害剤の作用点解析を可能にし、生理学・薬理学研究を加速させました。がん組織で見られる嫌気的解糖の亢進現象は後に「ワールブルク効果」と呼ばれ、エネルギー代謝研究の重要テーマとなりました。

ワールブルクは酵母および腫瘍組織から抽出したヘムタンパク質の差分スペクトルを解析し、複数のフェロ–フェリ転換を持つシトクロム系を同定した。シアン化物および一酸化炭素による酸素消費阻害とαバンドスペクトル変化を相関させ、終端酸化活性をシトクロムa3ヘム-CuBセンターに帰属した。CO光解離実験から得た結合・解離速度定数は、初期の酸化酵素反応動態を定量する値となった。2 H2＋O2→2 H2O の化学量論を実証し、過酸化物中間体の存在を生理条件下で否定した。ワールブルクは質量作用則に基づくベクトル的プロトン移動の概念を提示し、後のミッチェルの化学浸透説に先鞭をつけた。遠心分画で得た「呼吸顆粒」はミトコンドリアに相当し、in vitro での酸化活性が保持された。ADPによる呼吸制御の概念をChanceとWilliamsに先立って提示し、状態遷移モデルの原型を形成した。彼の定量的手法は複合体I–IVのポテンシャルマッピングとポテンシオメトリック滴定の設計指針となった。近年の構造生物学は、シトクロムcオキシダーゼのヘム-CuB中心がワールブルクの配位子阻害実験で示唆された通りのO2結合様式を有することを確認している。彼のメタボリックコントロール解析はシステムレベル研究の先駆けであり、ミトコンドリア遺伝子変異の病態評価でも参照基準となっている。